Mokslas. Lietuvoje ką tik išdalytos šiųmetės Lietuvos mokslo premijos. Vieną jų – biomedicinos ir žemės ūkio mokslų srityse – pelnė Vilniaus universiteto (VU) Biotechnologijos instituto tyrėjai.

Dr. Giedriui Sasnauskui, dr. Gintautui Tamulaičiui ir dr. Mindaugui Zarembai  premija įteikta už darbų ciklą „Nauji taikiniui specifinių endonukleazių sąveikos su DNR reguliacijos ir katalizės mechanizmai (2002–2013)“. Beje, šie mokslininkai – jau trečioji Biotechnologijos instituto restrikcijos-modifikacijos sistemų tyrinėtojų karta, įvertinta Lietuvos mokslo premija.

Nors šiųmečių laureatų darbai buvo orientuoti į fundamentinius tam tikrų fermentų (konkrečiai – restrikcijos endonukleazių) struktūros ir veikimo mechanizmus, jų aktyvumo tyrimus, gautos žinios turi didelį praktinio pritaikymo potencialą. Šie prieš daugiau nei 40 metų atrasti fermentai leido atsirasti šiuolaikinei genų inžinerijai, sukėlusiai revoliuciją biomedicininiuose tyrimuose ir biotechnologijos pramonėje.

Pabrėžtinas ir tas faktas, kad restrikcijos endonukleazės neatsiejamos ir nuo aukštųjų technologijų pramonės atsiradimo Lietuvoje, nes būtent jos leido suklestėti vienai sėkmingiausių aukštųjų technologijų įmonių Lietuvoje – „Fermentui“ (dabar „Thermo Fisher Scientific“ Vilniaus padalinys).

Restrikcijos endonukleazės neabejotinai yra paklausūs fermentai, su kuriais siejama daug vilčių. Tai lėmė intensyvias jų paieškas ir šiuo metu jau yra aprašyta per 4 tūkst. fermentų, atpažįstančių daugiau nei 300 skirtingų DNR sekų. Vis dėlto susiklostė įdomi situacija: jų sandaros ir veikimo mechanizmo tyrimai gerokai atsiliko nuo jų paieškos. Šį atsilikimą savo darbais ir bandė kompensuoti mūsų biotechnologai.

Daugiau nei dešimtmetį jų trukusių mokslinių tyrimų tikslas – suprasti, kaip veikia restrikcijos endonukleazės, išmokti keisti jų savybes ir pritaikyti jas naujiems tikslams. Kaip teigia M.Zaremba, siekiama gebėti keisti jų savybes, kad jos tarnautų norimoms užduotims.

Paprasčiau sakant, į restrikcijos endonukleazes galima žiūrėti kaip į tam tikras žirkles, galinčias paveikti, keisti svetimą genetinę informaciją – DNR. Įdomiausia ir labiausiai vaizduotę audrinanti sritis, kuriai tai gali pasitarnauti, yra genų terapija. Jos esmė – įstengti žmogaus ląstelės genome pakeisti blogą, kokias nors ligas lemiantį geną kitu – geru.

Nors tokio gydymo galimybės didžiulės, tai nėra paprasta. Tokioms didelio tikslumo reikalaujančioms genomo „operacijoms“ reikalingos ypatingu specifiškumu pasižyminčios endonukleazės, gebančios atpažinti ir sukarpyti tik blogojo geno vietoje esantį taikinį, o likusios – geros genetinės medžiagos dalies nepaveikti. Vienas esminių aspektų šiame procese yra tas, kaip tiksliai (kokio ilgio) šie fermentai sugeba atpažinti DNR taikinius. Kuo ilgesnius taikinius atpažįsta, tuo tikslumas didesnis (sutampančių trumpų taikinių būtų randama labai daug). Tai galima palyginti su ilgu tekstu: trumpi taikiniai yra tarsi pavieniai žodžiai, o ilgi taikiniai – frazės. Jei reikalingos vietos ieškai pagal pavienius žodžius, galimybių yra daug, tačiau jei pasitelki ilgesnius taikinius – frazes, tikimybė apsirikti stipriai sumažėja.

Pasaulyje šiam tikslui bandoma konstruoti ir naudoti įvairias ilgus DNR taikinius atpažįstančias endonukleazes. Viena iš galimybių – prie restrikcijos fermentų prijungti papildomus DNR atpažįstančius elementus, taip priverčiant restrikcijos endonukleazes atpažinti ilgesnius DNR taikinius.

Restrikcijos endonukleazės atpažįsta tik tam tikras DNR sekas (vieni fermentai atpažįsta vienas, kiti – kitas). Vis dėlto yra dalių, kurių neatpažįsta niekas. Kitaip tariant, bakterijose nėra atrasta tokių fermentų, kurie galėtų atpažinti mokslininkus dominančias DNR sekas.

„Žinodami jų detalią struktūrą, veikimo mechanizmą, kaip yra atpažįstama DNR, kaip ji perkerpama, galime keisti turimų fermentų specifiškumą (ką jie atpažįsta). Esmė ta, kad turime gana didelį įrankių arsenalą, tačiau norisi jį dar papildyti naujais specifiškumais“, – dėsto M.Zaremba.

Kaip paaiškina G.Sasnauskas, žmogui susidūrus su virusais – bakteriofagais, tai baigiasi sloga ar kažkokia kita nesunkia pagydoma liga, o virusams užpuolus bakterijas tai dažniausiai reiškia ląstelės žūtį. Kai bakteriją apipuola virusai, jie į ląstelės vidų įleidžia savo genetinę medžiagą – DNR. Tai reiškia, kad bakterija ne ims sintetinti tuos baltymus ir tas medžiagas, kurios reikalingos jos gyvavimui ar dalijimuisi, o pradės gaminti naujas viruso daleles. Kai jų bus prigaminta daug, ląstelė praplyš tarsi koks perpildyta maišas, naujos viruso dalelės pasklis į aplinką ir viskas prasidės iš naujo – taip pat bus puolamos ir kitos ląstelės. Atrodo, taip virusai galiausiai galėtų sunaikinti visą bakterijų populiaciją, juolab kad skaičiuojama, jog aplinkoje vienai bakterijai tenka bent penki ją puolantys virusai. Vis dėlto realybėje taip nenutinka, nes evoliucionuodamos bakterijos suformavo įvairių kovos su bakteriofagais būdų – apsaugos sistemų, saugančių bakterijas nuo sunaikinimo.

Tarp bakterijų ir virusų vyksta arši kova: bakterijos vis ieško naujų būdų, kaip apsiginti nuo virusų, o virusai stengiasi rasti kelių, kaip apeiti tas bakterijų apsaugos sistemas. Vaizdžiai mokslininkai tai vadina ginklavimosi varžybomis, o moksliškai –  koevoliucija. Taigi VU Biotechnologijos instituto tyrėjai savo darbuose ir gilinosi į vieną iš šių bakterijų apsaugos sistemų, padedančių ląstelei išsigelbėti nuo virusų.

„Šitos apsaugos sistemos esmė ta, kad kai prie bakterijos prisitvirtinantis virusas įleidžia į ją savo genetinę medžiagą (tai galima įsivaizduoti kaip tam tikrą ilgą siūlą), šią bandoma sunaikinti. Bakterijos viduje yra toks fermentas, kuris ir vadinasi restrikcijos endonukleaze. Jis, vaizdžiai tariant, yra tarsi dantuotas padaras, ties tam tikromis vietomis sukarpantis svetimą viruso genetinę medžiagą. Kai ji sukarpoma, ląstelei tampa nebekenksminga, nes virusas nebegali daugintis, – dėsto G.Sasnauskas. – Žinoma, yra ir kita pusė: juk pati bakterija turi savo genetinę medžiagą, tad kaip ją apsaugoti nuo to pikto fermento? Čia yra dar kitas fermentas, kuris ląstelės genetinę medžiagą ten, kur piktasis fermentas karpytų, tam tikra prasme pažymi, ją modifikuoja. Taip ląstelės DNR yra apsaugoma.“

„Tai konkrečiai vadinama restrikcijos-modifikacijos apsaugos sistema“, – prideda M.Zaremba.

Dėl šių žirklių kokį nors DNR fragmentą galima perkelti iš vieno organizmo DNR į kito organizmo DNR. Tarkime, žmogaus baltymą koduojantį geną galima perkelti į bakteriją ir tada, pavyzdžiui, insuliną ima sintetinti bakterijos. „Bakterija tampa tarsi bioreaktoriumi. Anksčiau insuliną reikėdavo išgryninti iš kiaulės kasos, jei norėjai suleisti žmogui, o šiuo metu tai gali padaryti bakterijos. Tai palengvina gyvenimą 200 mln. diabetikų pasaulyje“, – pavyzdį pateikia mokslininkai.

Tyrėjų darbai, už kuriuos jie ir pelnė šią premiją, tarsi susidėjo iš kelių prasminių dalių. Pirmiausia jie tyrė restrikcijos fermentų sąveiką su genetine medžiaga. Labiausiai juos domino, kaip šie fermentai atpažįsta atitinkamus DNR taikinius (kitaip tariant, kur reikia kirpti, o ko geriau neliesti). Tai tiriant (dėl to bendradarbiaujant ir su užsienio mokslininkais) jiems pavyko atrasti naują DNR taikinio atpažinimo būdą, kada fermentas, susirišdamas su DNR, ją stipriai deformuoja. Tai buvo pavadinta bazės išsukimu. „Tai yra tokiems fermentams visiškai naujas, pirmą kartą pasaulyje pastebėtas atpažinimo būdas“, – teigia G.Tamulaitis.

Kitaip tariant, šiame tyrimo etape parodyta, kaip, naudodami tuos pačius struktūrinius elementus, baltymai prisitaikė atpažinti skirtingo ilgio ir sekos DNR taikinius. Tai paskatino pradėti daugybę naujų tyrimų ir pasitarnavo fundamentinio mokslo plėtrai.

Per kitą tyrimų etapą buvo paneigtas įsišaknijęs įsitikinimas, kad visos endonukleazės yra panašios, kitaip tariant, kad jos turi bendrą kilmę, yra daugmaž panašios sandaros ir skiriasi gal tik atpažįstamais taikiniais ar dar kažkuo. Paaiškėjo, kad jos priklauso net penkioms negiminingoms šeimoms, tarsi penkioms atskiroms grupėms. Be to, fermentai gali būti labai įvairūs net kiekvienos šeimos viduje ir veikti skirtingais būdais (antra vertus, skirtingoms šeimoms priklausantys baltymai gali elgtis ir atrodyti labai panašiai, tai rodo, kad negiminingi baltymai evoliucionuodami tapo panašia, efektyviai savo apsauginę funkciją atliekančia struktūra).

„Tai, kad restrikcijos endonukleazės priklauso skirtingoms šeimoms, reiškia, jog bakterijos, kovodamos su virusais, „atrado“ jas bent penkis kartus. Tiesiog evoliucijos eigoje jos pagriebė ir pritaikė savo gynybai vis kažkokią kitokią nukleazę; kiekvienu atveju tai susikonstruodamos vis iš kitokių DNR atpažįstančių ir DNR kerpančių komponentų. Kai kuriais atvejais tie komponentai atrodo net nesusiję su DNR, – teigia G.Sasnauskas. – Tie fermentai yra labai keisti ir gali katalizuoti ne tik DNR kirpimo, bet ir visai kitokias reakcijas.“

Vadinasi, antras atrastas dalykas – pastebėtos naujos restrikcijos endonukleazių katalizuojamos reakcijos, pademonstruoti nauji sąveikos būdai. Tai potencialiai gali būti panaudojama ir kam nors kitam, ne vien genetinės medžiagos karpymui. Sakykime, naujos žinios galėtų pagelbėti bandymams sukonstruoti fermentus, galinčius atpažinti ilgus taikinius, genų terapijai, priversti restrikcijos endonukleazes atpažinti ilgesnius DNR taikinius.

„Iš tikrųjų, ką bandėme padaryti – tai sukurti naujus įrankius, tinkamus genų terapijai, taigi prie kažkokių fermentų, kurių esame nemažai ištyrę, pridėti papildomą modulį, taip pat galintį atpažinti genetinę medžiagą. Tada būtų reikalingas ilgas dvigubas taikinys: viena jo dalis būtų atpažįstama to prilieto modulio (tai gali būti ne tik baltymo domenas, bet ir kitokie dariniai), o kita dalis jau atpažintų paties fermento seką. Dėl to papildomo modulio fermentas atsidurtų ten, kur ir yra tas papildomo modulio atpažinimo taikinys, – aiškina M.Zaremba. – Iš to išeina, kad toks hibridinis daiktas gali atpažinti labai ilgą taikinį ir gali būti naudojamas genų terapijoje, kai žmogaus genome ir reikia atpažinti ilgus, unikalius taikinius. Pademonstravome porą strategijų, kaip sugebama kirpti tik reikiamus taikinius. Aišku, fermentai vis vien kirps savo taikinius, tačiau jau atvedus prie kažkokių norimų vietų.“

Vadinasi, prie restrikcijos fermentų prijungus papildomus su DNR sąveikaujančius modulius ir taip pailginus jų atpažįstamą taikinį, tokia DNR endonukleazė būtų nukreipiama į konkrečią vietą, pavyzdžiui, esančią pire blogo, nepageidaujamo geno.

Žinoma, čia irgi yra savų iššūkių. Pagrindinis – vėlgi kaip priversti šį hibridinį fermentą atpažinti ir kirpti tik pailgintą savo taikinį ir neliesti kitų genome esančių taikinių, nekirpti trumpesnių. Dėl šios problemos buvo sukurta metodų, leidžiančių reguliuoti tokių hibridinių darinių aktyvumą, kad jie imtų veikti tik tada, kai reikia. Tai reiškia, kad atsirado galimybių pakreipti procesą norima linkme. Vienas tokių būdų – su šviesa. Prie fermento galima prijungti tokią cheminę grupę, kuri neleistų susidaryti aktyviai fermento formai. Jei ši prijungta cheminė grupė yra jautri šviesai, reikiamu momentu pašvietus į šį fermentą ta cheminė grupė atsijungtų, fermentas taptų aktyvus ir galėtų karpyti.

Yra ir kitas būdas, kaip galima padaryti, kad fermentas imtų veikti tik patekęs į reikiamą vietą. Paimamas fermentas, esantis neaktyvioje formoje. Kad jis taptų aktyvus, turi susijungti dvi fermentų molekulės. Tai įvyksta, kai dvi fermento molekulės atpažįsta du greta esančius ilgus taikinius, atsiduria viena šalia kitos, susijungia, fermentas tampa aktyvus, ir norimoje vietoje perkerpama genetinė medžiaga.

Galima apibendrinti, kad naujos žinios leido pasiūlyti būdų, kaip turimus restrikcijos fermentus paversti naujais pakitusio aktyvumo, didesnio specifiškumo ar kontroliuojamo aktyvumo įrankiais, tinkamais sudėtingesnėms, nei paprasta genų inžinerija, užduotims atlikti.

Kas toliau? Kuria kryptimi judės Lietuvos mokslo premiją gavusių mokslininkų tyrimai?

„Palikti šią sritį būtų labai gaila, nes ji iš tiesų labai įdomi, fermentų yra labai įvairių (kiekvienas jų gali vis kitaip atlikti tą pačią reakciją), be to, čia jau padarytas didelis įdirbis. Aš, pavyzdžiui, ir toliau dirbu prie tyrimų, susijusių su restrikcijos endonukleazėmis, tik jau prie kitokio tipo. Jos naudoja tarsi degalus (ATP hidrolizę), kad atliktų šią funkciją. Taip pat orientuojuosi ir į kitus bakterijų apsaugos nuo bakteriofagų fermentus“, – sako M.Zaremba.

G.Tamulaitis jau dabar dirba prie naujos bakterijų apsaugos sistemos, leidžiančios lengviau ją programuoti ir pritaikyti genų terapijos, genų inžinerijos tikslams. Sukaupta patirtis, atliekant naują darbą, jam labai padeda, nes tai taip pat yra endonukleazė, tad dėsningumai atsikartoja.

Galiausiai G.Sasnauskas, kaip pats sako, dar turi nesuvestų sąskaitų su dalimi fermentų, tad kol kas dar dirba prie tos pačios temos. „Bakterijų apsaugos sistemų tyrimai atskleidė labai daug naujų įdomių bakterijose vykstančių procesų, kurių prieš dešimtmetį dar neįsivaizdavome. Kartu labai įdomu, kaip fundamentinis atradimas leido atrasti naujų įrankių, metodų. Ko gero, dabar galime laukti realaus proveržio genų terapijos srityje, nes juos lengva taikyti“, – svarsto mokslininkas.

„Pažanga labai staigi. Naujos bakterijų apsaugos sistemos atrastos prieš septynerius aštuonerius metus, o šioje srityje padaryta, suprasta labai daug. Biotechnologijų mokslo tempas itin greitas. Tai labai karšta sritis, nors, aišku, tai reiškia, kad egzistuoja didelė konkurencija su kitomis laboratorijomis pasaulyje“, – apibendrina G.Tamulaitis.

Žinoma, tai reiškia ir aktyvesnį mokslininkų bendradarbiavimą. Atliekant kai kuriuos tyrimus dirbta su lenkais, britais, amerikiečiais, vokiečiais, japonais, olandais… Tai naudinga ne tik dėl žinių sklaidos, bet ir dėl žemiškesnių dalykų. Tarkime, kokia nors laboratorija užsienyje turi mūsų mokslininkams reikalingą, tačiau labai brangų įrenginį ir daug patirties dirbant su juo, o šie turi įdomų tyrimų objektą, taigi bendradarbiaujant gali lengviau gimti rezultatas, galima atrasti naujų dalykų.

Vaiva Sapetkaitė