Vilniaus universiteto (VU) Biochemijos institute prie pabaigos eina projektas, orientuotas į oksigenazių – fermentų, galinčių oksiduoti organinius junginius, paiešką. Jų potencialas pramoninio pritaikymo požiūriu – didžiulis.

Vaiva Sapetkaitė

Šį balandį baigsis dvejus metus trukęs projektas, kurio metu VU Biochemijos instituto mokslininkai kūrė ir tobulino metodus, kaip atrasti mikroorganizmus, galinčius hidroksilinti piridino žiedą, arba, jei šie negali būti kultivuojami laboratorijos sąlygomis, kaip padaryti, kad laboratorijoje galinčios augti bakterijos perimtų dalį tų mikroorganizmų genų.

Skirtingi fermentai gali „suvalgyti“ bet kokius junginius

Molekulinės mikrobiologijos ir biotechnologijos skyriaus vedėjas prof. dr. Rolandas Meškys, vadovavęs šiam projektui, primena, kad fermentams būdingas atrankumas substratui, tai yra kiekvienas jų sąveikauja su specifine medžiaga. „Bet kokia ląstelė, norinti pasidalyti, turi „pavalgyti“ ir tas medžiagas, kurių gauna iš aplinkos, paversti tomis, kurios jai reikalingos. Šiuo požiūriu mikroorganizmų esama be galo įvairių. Mes, žmonės, galime valgyti gliukozę, riebalus ir baltymus, o su mikroorganizmais yra visai kitaip. Dalis jų gali „valgyti“ gliukozę, vandenilį, anglies dvideginį, metaną, naftaleną, organinius tirpiklius, benziną, pesticidus…“ – dėsto profesorius.

Kad mikroorganizmai galėtų tai padaryti, jiems būtini tam tikri fermentai – baltyminiai biokatalizatoriai, dėl kurių vyksta tam tikros cheminės reakcijos. Vaizdžiai tariant, tam, kad mikroorganizmai iš vieno junginio galėtų padaryti kitą, juose turi veikti tam tikras chemijos fabrikas. Ir kadangi kiekviena mikroorganizmų rūšis sau reikalingų medžiagų pasigamina savitu būdu, ši savybė atveria daug tolesnio fermentų taikymo galimybių.

Kita vertus, viskas nėra taip paprasta. Norint įdarbinti mikroorganizmus, pirmiausia juos reikia mokėti surasti. Čia ir prasideda sunkumai. Mikroorganizmų biocheminė įvairovė yra milžiniška. Skaičiuojama, kad viename grame dirvožemio gali būti iki milijono rūšių mikroorganizmų, taigi pirmiausia reikia žinoti, ko ieškai. Tam reikia sukurti metodus, leidžiančius gamtoje paprasčiau aptikti mikroorganizmus, galinčius sintetinti norimus junginius.

Tiesa, ieškodami tam tikro mikroorganizmo mokslininkai vis vien nėra garantuoti, kad jis skaidys būtent tokį junginį, kokio norima. Gali nutikti ir taip, kad ieškomas mikroorganizmas gamtoje apskritai neegzistuoja.

Taigi, netrūkstant neapibrėžtumo, svarbu sukurti kuo veiksmingesnę norimo biokatalizatoriaus atrankos metodiką. Tai buvo ir vienas iš vykdyto projekto uždavinių, dirbant su piridino žiedu. Galima pasidžiaugti, kad pasiekta gerų rezultatų. Vis dėlto mokslininkams reikalus stipriai apsunkino tai, kad 95–99 proc. iš daugybės gamtoje egzistuojančių mikroorganizmų laboratorijos sąlygomis neauga.

„Tada reikia atsiminti biologijos pagrindus: jei ląstelėje yra baltymas, fermentas, jį koduoja tam tikras genas. Vadinasi, jei pasitelkę genų inžineriją galėtume „ištraukti“, klonuoti genus, pavyktų išskirti DNR ir iš laboratorijose nekultivuojamų mikroorganizmų. Tada belieka tuos genus perkelti į tuos mikroorganizmus, kuriuos galima išauginti laboratorijoje“, – aiškina R.Meškys.

Schema tokia: klonuojame tam tikrus DNR fragmentus ir rekombinantinėmis molekulėmis transformuojame, pavyzdžiui, į žarnyno lazdeles – į vienas iš bakterijų, puikiai augančių laboratorijos sąlygomis. Gauname milijonus skirtingų žarnyno lazdelių variantų, kurių kiekvienas turi tam tikrą ankstesnio genomo fragmentą. Jei, sakykime, turime dirvožemį ar žarnyno turinį, iš to galime išskirti suminę DNR, kur bus įvairiausių DNR molekulių. Kiekvieną fragmentą galima įterpti į tam tikrą seką, kurios gali imti autonomiškai daugintis kad ir minėtose žarnyno lazdelėse.

„Tikimės, kad jei čia bus reikiamas genas ir jis bus nuskaitytas bei susintetintas kažkoks fermentas, jei tas fermentas bus aktyvus ir jo aktyvumui nustatyti turėsime tinkamą metodą (pavyzdžiui, pakišime jam medžiagą, kurią jis veikia, ir produktas, sakykime, taps spalvotas), yra didelė tikimybė, kad bakterija gamins būtent reikiamą fermentą. Jei taip – jau turime jo geną. Tokiu būdu genų galime ieškoti net tokiose bakterijose, kurios nekultivuojamos laboratorijose“, – paaiškina R.Meškys.

Atrasti nauji fermentai piridino žiedui hidroksilinti

Kadangi fermentų rūšių yra tūkstančiai ir visko iškart tirti neįmanoma, projekte koncentruotasi į oksigenazes. Pasak R.Meškio, vykdomo projekto tikslas – išgauti fermentų, gebančių hidroksilinti piridino žiedą. Mąstyta, kad jei pavyktų išskirti bakterijų, „valgančių“, tai yra skaidančių, piridiną, yra didesnė tikimybė, kad jos, o ne, pavyzdžiui, skaidančios gliukozę, turės ieškomų fermentų. „Taigi, jei vietoj gliukozės kaip anglies šaltinį dėtume piridiną (iš pradžių atsirinkę jį skaidančias bakterijas), vadinasi, tikimybė atrasti fermentų, kurie gali hidroksilinti tą junginį, yra didesnė tokiose bakterijose“, – teigia mokslininkas.

Projekte buvo panaudota įvairių piridino junginių, kaip anglies šaltinių bakterijoms, gebančioms juos skaidyti, ir jau jose ieškota norimų fermentų. Ir buvo rasta. Taigi vienas didžiausių projekto laimėjimų – atrasti unikalūs fermentai, tam tikru būdu hidroksilinantys piridino žiedą. Šis atradimas svarbus dviem aspektais: dėl įnašo į fundamentalųjį mokslą ir potencialo rasti pritaikymą pramonėje. Trumpai tariant, mokslininkams pavyko įrodyti, kad egzistuoja dar viena fermentų grupė, katalizuojanti tam tikras reakcijas. Tai paskatino gilintis į vykstančios reakcijos mechanizmus ir bandyti atitinkamus fermentus priversti dirbti kitoje ląstelėje, klonuojant jų genus.

„Kai jau turi geną, atsiranda galimybė jį keisti. Jei pakeistume kokias nors aminorūgštis baltyme, galima tikėtis, kad pasikeistų ir šio fermento savybės, o kai kurie iš gautų variantų galbūt galėtų oksiduoti ir kitus piridino darinius. Taip pakeičiamas jo atrankumas. O juk piridino junginių yra labai daug“, – priduria profesorius.

Paminėtina, kad piridino katabolizmo tyrimai VU Biochemijos institutui nebuvo naujas dalykas: piridino junginių skaidymo procesai mikroorganizmuose čia tiriami jau ne vienus metus.

Fermentų potencialas pramonėje

Pasaulinėje chemijos pramonėje netrūksta problemų, susijusių su efektyvumu, tarša ar kaina. Nors šiuolaikinė chemijos pramonė gali padaryti daug ką, tai neretai pareikalauja santykinai didelių sąnaudų, sunkiau valdomų, ilgesnių procesų. Jei sugebėtume įdarbinti biokatalizatorius, analogiškus procesus galėtume vykdyti ekologiškai palankesnėmis sąlygomis ir, tikėtina, efektyviau. Nenuostabu, kad biokatalizė, vadinamoji žalioji chemija, yra itin svarbi biochemijos mokslo kryptis. Be vaistų pramonės ir medicinos, būtent čia slypi vienas didžiausių biotechnologijų potencialų.

Kad pramonėje galėtų būti panaudojami mikroorganizmai, turintys įvairių biokatalizatorių, nėra nauja mintis. Taigi chemikai, užuot naudoję įvairius sintetinius katalizatorius, galbūt galėtų naudoti fermentus. Tai aktualu jau vien dėl to, kad procesai galėtų būti vykdomi švelnesnėmis, paprastesnėmis sąlygomis.

Paprastas pavyzdys: dirvožemyje mikroorganizmai gyvena, sakykime, esant 20 laipsnių temperatūrai, vandeninėje terpėje ir sugeba tokiomis švelniomis sąlygomis susintetinti net ir itin sudėtingus junginius. Kad chemikas padarytų tą patį, jam neretai prireiks šimto laipsnių temperatūros, šimto atmosferų, dar kažko. Be to, tam, ką chemikas gali padaryti per dešimt ar penkiolika sintetinimo stadijų, fermentui pasiekti dažnai prireikia kur kas mažiau etapų.

Dar vienas niuansas: chemijos pramonėje neretai kyla problema, kad chemikui naudojant tam tikrus oksidatorius gali būti gaunamas kažkoks mišinys, o fermentas veikia atrankiai ir kur kas tiksliau (atlieka net ryšio vietai atrankias reakcijas). Taigi chemikas, gavęs reikalingą junginį, dar turės jį išgryninti, pašalinti susidariusius šalutinius produktus.

„Vis dėlto mūsų užduotis yra atrasti ne tik fermentus, galinčius atlikti vienokią ar kitokią norimą reakciją, bet ir platesnį reakcijos panaudojimą. Tarkime, atliekama ta pati reakcija, tik su skirtingais junginiais, kitaip sakant, katalizuojama skirtingų junginių oksidacija toje pačioje vietoje. Taip suteikiama galimybė gauti ne vieną, o visą grupę junginių. Nors katalizatorius yra tas pats, pasirenkamas šiek tiek kitoks substratas leidžia gauti skirtingą produktą“, – pabrėžia R.Meškys.

Aišku, atsiveriančios galimybės turi apsimokėti. Jei tai bus brangiau už jau naudojamus cheminius katalizatorius, fermentams bus sunku tapti masiškai naudojamais. Žinoma, jų, kaip ir visų technologijų bei inovacijų, sąnaudos laikui einant mažėja, o tai nuteikia optimistiškai.

Visuotinės dotacijos priemonė administruojama ir viešinama ESF lėšomis, įgyvendinant projektą „Lietuvos mokslo tarybai pavestų funkcijų, įgyvendinant priemonę VP1-3.1-ŠMM-07-K „Parama mokslininkų ir kitų tyrėjų mokslinei veiklai (visuotinė dotacija)“ vykdymas, projekto Nr. VP1-5.1-FM-01-V-02-001. Projektas finansuojamas Europos socialinio fondo (ESF) lėšomis pagal Žmogiškųjų išteklių plėtros veiksmų programą. Projektas „Keiskis arba mirk: oksidoreduktazių perkonstravimas (CHORD)“, projekto kodas VP1-3.1-ŠMM-07-K-03-015

ERPF SF kuriame_LT_ateiti_CMYK-01 Manto